სინათლის შთანთქმა და შემდგომი ხელახალი გამოსხივება არაორგანული და ორგანული საშუალებებით არის ფოსფორესცენციის ან ფლუორესცენციის შედეგი. ფენომენებს შორის განსხვავება არის ნაკადის სინათლის შთანთქმასა და გამოსხივებას შორის ინტერვალის სიგრძე. ფლუორესცენციის დროს ეს პროცესები თითქმის ერთდროულად ხდება, ხოლო ფოსფორესცენციის დროს გარკვეული დაგვიანებით.
ისტორიული ფონი
1852 წელს ბრიტანელმა მეცნიერმა სტოკსმა პირველად აღწერა ფლუორესცენცია. მან ახალი ტერმინი გამოიგონა ფტორსპართან ექსპერიმენტების შედეგად, რომელიც წითელ შუქს ასხივებდა ულტრაიისფერი შუქის ზემოქმედებისას. სტოკსმა აღნიშნა საინტერესო ფენომენი. მან აღმოაჩინა, რომ ფლუორესცენტური სინათლის ტალღის სიგრძე ყოველთვის აღგზნების სინათლის ტალღის სიგრძეა.
ბევრი ექსპერიმენტი ჩატარდა მე-19 საუკუნეში ჰიპოთეზის დასადასტურებლად. მათ აჩვენეს, რომ ულტრაიისფერი შუქის ზემოქმედების დროს სხვადასხვა ნიმუშები ფლუორესცირდება. მასალები მოიცავს, მათ შორის, კრისტალებს, ფისებს, მინერალებს, ქლოროფილს,სამკურნალო ნედლეული, არაორგანული ნაერთები, ვიტამინები, ზეთები. საღებავების პირდაპირი გამოყენება ბიოლოგიური ანალიზისთვის დაიწყო მხოლოდ 1930 წელს
ფლუორესცენტური მიკროსკოპის აღწერა
მე-20 საუკუნის პირველ ნახევარში კვლევებში გამოყენებული ზოგიერთი მასალა ძალიან სპეციფიკური იყო. ინდიკატორების წყალობით, რომლებიც ვერ მიიღწევა კონტრასტული მეთოდებით, ფლუორესცენტული მიკროსკოპის მეთოდი გახდა მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი როგორც ბიოსამედიცინო, ასევე ბიოლოგიურ კვლევაში. მიღებულ შედეგებს არ ჰქონდა მცირე მნიშვნელობა მასალების მეცნიერებისთვის.
რა სარგებლობა მოაქვს ფლუორესცენციულ მიკროსკოპს? ახალი მასალების დახმარებით შესაძლებელი გახდა უაღრესად სპეციფიკური უჯრედების და სუბმიკროსკოპული კომპონენტების იზოლირება. ფლუორესცენტური მიკროსკოპი საშუალებას გაძლევთ ამოიცნოთ ცალკეული მოლეკულები. მრავალფეროვანი საღებავები საშუალებას გაძლევთ ამოიცნოთ რამდენიმე ელემენტი ერთდროულად. მიუხედავად იმისა, რომ აღჭურვილობის სივრცითი გარჩევადობა შეზღუდულია დიფრაქციული ლიმიტით, რაც, თავის მხრივ, დამოკიდებულია ნიმუშის სპეციფიკურ თვისებებზე, ამ დონის ქვემოთ მოლეკულების აღმოჩენაც სავსებით შესაძლებელია. სხვადასხვა ნიმუშები ავლენენ ავტოფლუორესცენციას დასხივების შემდეგ. ეს ფენომენი ფართოდ გამოიყენება პეტროლოგიის, ბოტანიკის, ნახევარგამტარების ინდუსტრიაში.
ფუნქციები
ცხოველთა ქსოვილების ან პათოგენური მიკროორგანიზმების შესწავლა ხშირად რთულდება ძალიან სუსტი ან ძალიან ძლიერი არასპეციფიკური ავტოფლუორესცენციით. თუმცა, ღირებულება inკვლევა იძენს მასალაში კომპონენტების შეყვანას, რომლებიც აღგზნებულია კონკრეტული ტალღის სიგრძეზე და ასხივებს საჭირო ინტენსივობის სინათლის ნაკადს. ფტოროქრომები მოქმედებს როგორც საღებავები, რომლებსაც შეუძლიათ თვითმიმაგრება სტრუქტურებთან (უხილავი ან ხილული). ამავდროულად, ისინი გამოირჩევიან მაღალი სელექციურობით სამიზნეებთან და კვანტურ მოსავლიანობასთან მიმართებაში.
ფლუორესცენციული მიკროსკოპია ფართოდ გამოიყენება ბუნებრივი და სინთეზური საღებავების მოსვლასთან ერთად. მათ ჰქონდათ ემისიის და აგზნების ინტენსივობის სპეციფიკური პროფილები და მიმართული იყო კონკრეტულ ბიოლოგიურ სამიზნეებზე.
ცალკეული მოლეკულების იდენტიფიკაცია
ხშირად, იდეალურ პირობებში, შეგიძლიათ დაარეგისტრიროთ ერთი ელემენტის ბზინვარება. ამისათვის, სხვა საკითხებთან ერთად, აუცილებელია საკმარისად დაბალი დეტექტორის ხმაური და ოპტიკური ფონი. ფლუორესცეინის მოლეკულას შეუძლია 300000-მდე ფოტონის გამოსხივება ფოტოგათეთრების გამო განადგურებამდე. 20% შეგროვების კოეფიციენტით და პროცესის ეფექტურობით, მათი რეგისტრაცია შესაძლებელია დაახლოებით 60 ათასი
ოდენობით.
ფლუორესცენტური მიკროსკოპია, რომელიც დაფუძნებულია ზვავის ფოტოდიოდებზე ან ელექტრონების გამრავლებაზე, მკვლევარებს საშუალებას აძლევდა დაეკვირვებინათ ცალკეული მოლეკულების ქცევა წამებით და ზოგიერთ შემთხვევაში წუთებით.
სიძნელეები
მთავარი პრობლემა არის ხმაურის ჩახშობა ოპტიკური ფონიდან. გამომდინარე იქიდან, რომ ფილტრებისა და ლინზების მშენებლობაში გამოყენებული ბევრი მასალა ავლენს გარკვეულ ავტოფლუორესცენციას, მეცნიერთა ძალისხმევა საწყის ეტაპებზე ორიენტირებული იყო გამოშვებაზე.კომპონენტები დაბალი ფლუორესცენციით. თუმცა, შემდგომმა ექსპერიმენტებმა ახალი დასკვნები გამოიწვია. კერძოდ, მთლიან შიდა არეკვლაზე დაფუძნებული ფლუორესცენციული მიკროსკოპით, აღმოჩნდა, რომ მიიღწევა დაბალი ფონის და მაღალი აგზნების სინათლის გამომუშავება.
მექანიზმი
ფლუორესცენციული მიკროსკოპიის პრინციპები, რომელიც დაფუძნებულია მთლიან შიდა ასახვაზე, არის სწრაფად გახრწნილი ან არაგამავრცელებელი ტალღის გამოყენება. ის წარმოიქმნება სხვადასხვა რეფრაქციული ინდექსის მქონე მედიას შორის ინტერფეისზე. ამ შემთხვევაში სინათლის სხივი გადის პრიზმაში. მას აქვს მაღალი რეფრაქციული ინდექსი.
პრიზმა არის წყალხსნარის ან დაბალი პარამეტრის მინის მიმდებარედ. თუ სინათლის სხივი მიმართულია მასზე კრიტიკულზე მეტი კუთხით, სხივი მთლიანად აირეკლება ინტერფეისიდან. ეს ფენომენი, თავის მხრივ, იწვევს არაგამავრცელებელ ტალღას. სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, წარმოიქმნება ელექტრომაგნიტური ველი, რომელიც 200 ნანომეტრზე ნაკლებ მანძილზე შეაღწევს გარემოში უფრო დაბალი გარდატეხის ინდექსით.
არაგავრცელებულ ტალღაში სინათლის ინტენსივობა საკმაოდ საკმარისი იქნება ფტორფორების აღგზნებისთვის. თუმცა, მისი უკიდურესად არაღრმა სიღრმის გამო, მისი მოცულობა ძალიან მცირე იქნება. შედეგი არის დაბალი დონის ფონი.
მოდიფიკაცია
ფლუორესცენტული მიკროსკოპია, რომელიც დაფუძნებულია მთლიან შიდა ასახვაზე, შეიძლება განხორციელდეს ეპი-განათებით.ამისათვის საჭიროა ლინზები გაზრდილი რიცხვითი დიაფრაგმით (მინიმუმ 1.4, მაგრამ სასურველია, რომ მიაღწიოს 1.45-1.6), ასევე აპარატის ნაწილობრივ განათებულ ველს. ეს უკანასკნელი მიიღწევა პატარა ლაქით. უფრო მეტი ერთგვაროვნებისთვის გამოიყენება თხელი რგოლი, რომლის მეშვეობითაც ნაკადის ნაწილი იკეტება. კრიტიკული კუთხის მისაღებად, რომლის შემდეგაც ხდება მთლიანი არეკვლა, საჭიროა ჩაძირვის საშუალების მაღალი რეფრაქციის დონე ლინზებში და მიკროსკოპის საფარის შუშაში.
