მოლეკულური ბიოლოგიური კვლევის მეთოდები დიდ როლს თამაშობს თანამედროვე მედიცინაში, სასამართლო და ბიოლოგიაში. დნმ-ისა და რნმ-ის შესწავლის მიღწევების წყალობით ადამიანს შეუძლია შეისწავლოს ორგანიზმის გენომი, დაადგინოს დაავადების გამომწვევი აგენტი, ამოიცნოს სასურველი ნუკლეინის მჟავა მჟავების ნარევში და ა.შ.
მოლეკულური ბიოლოგიური კვლევის მეთოდები. რა არის ეს?
ჯერ 70-იან და 80-იან წლებში მეცნიერებმა პირველად მოახერხეს ადამიანის გენომის გაშიფვრა. ამ მოვლენამ ბიძგი მისცა გენეტიკური ინჟინერიისა და მოლეკულური ბიოლოგიის განვითარებას. დნმ-ისა და რნმ-ის თვისებების შესწავლამ განაპირობა ის, რომ უკვე შესაძლებელია ამ ნუკლეინის მჟავების გამოყენება დაავადების დიაგნოსტიკის მიზნით, გენების შესასწავლად.
დნმ-ისა და რნმ-ის მიღება
მოლეკულური ბიოლოგიური დიაგნოსტიკური მეთოდები მოითხოვს საწყისი მასალის არსებობას: უფრო ხშირად ეს არის ნუკლეინის მჟავები. ამ ნივთიერებების ცოცხალი ორგანიზმების უჯრედებიდან გამოყოფის რამდენიმე გზა არსებობს. თითოეულ მათგანს აქვს თავისი დადებითი და უარყოფითი მხარეები და ეს აუცილებელიაგაითვალისწინეთ სუფთა ნუკლეინის მჟავების გამოყოფის მეთოდის არჩევისას.
1. დნმ-ის მიღება მარმურის მიხედვით. მეთოდი შედგება ნივთიერებების ნარევის სპირტით დამუშავებაში, რის შედეგადაც სუფთა დნმ ილექება. ამ მეთოდის მინუსი არის აგრესიული ნივთიერებების გამოყენება: ფენოლი და ქლოროფორმი.
2. დნმ-ის იზოლაცია ბუმის მიხედვით. აქ გამოყენებული ძირითადი ნივთიერება არის გუანიდინის თიოციანატი (GuSCN). ის ხელს უწყობს დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის დალექვას სპეციალიზებულ სუბსტრატებზე, საიდანაც შემდგომში მისი შეგროვება შესაძლებელია სპეციალური ბუფერის გამოყენებით. თუმცა, GuSCN არის PTC-ის ინჰიბიტორი და მისი მცირე ნაწილიც კი, რომელიც ხვდება ნალექის დნმ-ში, შეუძლია გავლენა მოახდინოს პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მიმდინარეობაზე, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ნუკლეინის მჟავებთან მუშაობაში.
3. მინარევების დალექვა. მეთოდი განსხვავდება წინა მეთოდებისგან იმით, რომ ნალექი ხდება არა დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის მოლეკულები, არამედ მინარევები. ამისათვის გამოიყენება იონური გადამცვლელები. მინუსი ის არის, რომ ყველა ნივთიერებას არ შეუძლია დალექოს.
4. მასობრივი სკრინინგი. ეს მეთოდი გამოიყენება იმ შემთხვევებში, როდესაც არ არის საჭირო ზუსტი ინფორმაცია დნმ-ის მოლეკულის შემადგენლობის შესახებ, მაგრამ საჭიროა გარკვეული სტატისტიკური მონაცემების მიღება. ეს აიხსნება იმით, რომ ნუკლეინის მჟავას სტრუქტურა შეიძლება დაზიანდეს სარეცხი საშუალებებით, კერძოდ ტუტეებით დამუშავებისას.
კვლევის მეთოდების კლასიფიკაცია
მოლეკულური ბიოლოგიური კვლევის ყველა მეთოდი იყოფა სამ დიდ ჯგუფად:
1. გაძლიერება (ბევრი ფერმენტის გამოყენებით). Აქეხება PCR - პოლიმერაზულ ჯაჭვურ რეაქციას, რომელიც დიდ როლს ასრულებს მრავალ დიაგნოსტიკურ მეთოდში.
2. არაგამაძლიერებელი. მეთოდების ეს ჯგუფი პირდაპირ კავშირშია ნუკლეინის მჟავების ნარევების მუშაობასთან. მაგალითებია 3 ბლოტი, in situ ჰიბრიდიზაცია და ა.შ.
3. მეთოდები, რომლებიც ეფუძნება სიგნალის ამოცნობას ზონდის მოლეკულიდან, რომელიც აკავშირებს სპეციფიკურ ზონდს დნმ-ს ან რნმ-ს. ამის მაგალითია ჰიბრიდული დაჭერის სისტემა (hc2).
ფერმენტები, რომლებიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას მოლეკულური ბიოლოგიის კვლევის მეთოდებში
ბევრი მოლეკულური დიაგნოსტიკური მეთოდი მოიცავს ფერმენტების ფართო სპექტრის გამოყენებას. ქვემოთ მოცემულია ყველაზე ხშირად გამოყენებული:
1. რესტრიქციული ფერმენტი – „ჭრის“დნმ-ის მოლეკულას საჭირო ნაწილებად.
2. დნმ პოლიმერაზა - ასინთეზებს დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის ორჯაჭვიან მოლეკულას.
3. საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა (რევერტაზა) - გამოიყენება რნმ-ის შაბლონზე დნმ-ის სინთეზისთვის.
4. დნმ ლიგაზა - პასუხისმგებელია ნუკლეოტიდებს შორის ფოსფოდიესტერული ბმების წარმოქმნაზე.
5. ეგზონუკლეაზა - აშორებს ნუკლეოტიდებს დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის მოლეკულის ბოლო სექციებიდან.
PCR არის დნმ-ის ამპლიფიკაციის მთავარი მეთოდი
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) აქტიურად გამოიყენება თანამედროვე მოლეკულურ ბიოლოგიაში. ეს არის მეთოდი, რომლის დროსაც შესაძლებელია დნმ-ის ერთი მოლეკულისგან დიდი რაოდენობით ასლების მიღება (მოლეკულები გაძლიერებულია).
PCR-ის ძირითადი ფუნქციები:
- დიაგნოსტიკადაავადებები;
- დნმ-ის სეგმენტების, გენების კლონირება.
პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის განსახორციელებლად საჭიროა შემდეგი ელემენტები: საწყისი დნმ-ის მოლეკულა, თერმოსტაბილური დნმ-ის პოლიმერაზა (Taq ან Pfu), დეზოქსირიბონუკლეოტიდური ფოსფატები (აზოტოვანი ბაზების წყაროები), პრაიმერები (2 პრაიმერი 1 დნმ-ის მოლეკულაზე).) და თავად ბუფერული სისტემა, რომელშიც ყველა რეაქცია შესაძლებელია.
PCR შედგება სამი ეტაპისგან: დენატურაცია, პრაიმერის ანილირება და დრეკადობა.
1. დენატურაცია. 94-95 გრადუს ცელსიუს ტემპერატურაზე წყდება წყალბადის ბმები დნმ-ის ორ ჯაჭვს შორის და შედეგად ვიღებთ ორ ერთჯაჭვიან მოლეკულას..
2. პრაიმერის ანილირება. 50-60 გრადუს ცელსიუს ტემპერატურაზე პრაიმერები მიმაგრებულია ერთჯაჭვიანი ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების ბოლოებზე კომპლემენტარობის ტიპის მიხედვით..
3. დრეკადობა. 72 გრადუს ტემპერატურაზე ხდება დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის ქალიშვილის ორჯაჭვიანი მოლეკულების სინთეზი.
დნმ-ის თანმიმდევრობა
მოლეკულური ბიოლოგიური კვლევის მეთოდები ხშირად მოითხოვს დეზოქსირიბონუკლეინის მჟავის მოლეკულაში ნუკლეოტიდების თანმიმდევრობის ცოდნას. თანმიმდევრობა ტარდება გენეტიკური კოდის დასადგენად. მომავლის მოლეკულური დიაგნოსტიკა დაფუძნებული იქნება ადამიანის თანმიმდევრობის შედეგად მიღებულ ცოდნაზე.
მიმდევრობის შემდეგი ტიპები გამოირჩევა:
- მაქსამ-გილბერტის თანმიმდევრობა;
- სენჯერის თანმიმდევრობა;
- პიროსთანმიმდევრობა;
- ნანოფორათანმიმდევრობა.
