რა უდევს საფუძვლად დნმ-ის ჰიბრიდიზაციას? მიუხედავად იმისა, რომ ორჯაჭვიანი დნმ-ის თანმიმდევრობა ზოგადად სტაბილურია ფიზიოლოგიურ პირობებში, ამ პირობების შეცვლა ლაბორატორიაში (როგორც წესი, გარემოს ტემპერატურის ამაღლებით) გამოიწვევს მოლეკულების ცალკეულ ძაფებად დაყოფას. ეს უკანასკნელი ავსებს ერთმანეთს, მაგრამ ასევე შეიძლება შეავსოს მათ გარემოში არსებული სხვა თანმიმდევრობები. ატმოსფერული ტემპერატურის დაწევა საშუალებას აძლევს ერთჯაჭვიან მოლეკულებს ერთმანეთთან ანეილების ან „ჰიბრიდიზაციის“საშუალებას. ეს არის დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის მეთოდი.
კონცეფცია მოლეკულური ბიოლოგიის თვალსაზრისით
მეცნიერები, რომლებიც მონაწილეობენ როგორც დნმ-ის რეპლიკაციაში, ასევე დნმ-ის რნმ-ში ტრანსკრიფციაში, ეყრდნობიან ნუკლეოტიდურ გადაკვეთებს და მოლეკულური ბიოლოგიის ტექნიკას. ეს მოიცავს სამხრეთისა და ჩრდილოეთის ლაქებს, პოლიმერაზულ ჯაჭვურ რეაქციას (PCR) და დნმ-რნმ-ის ჰიბრიდიზაციისა და თანმიმდევრობის მიდგომების უმეტესობას.
აპლიკაცია
ჰიბრიდიზაცია ნუკლეოტიდის მთავარი თვისებაათანმიმდევრობით და გამოიყენება მოლეკულური ბიოლოგიის მრავალ მეთოდში. ორი სახეობის საერთო გენეტიკური ურთიერთობა შეიძლება განისაზღვროს მათი დნმ-ის სეგმენტების ჰიბრიდიზაციის გზით (დნმ-დნმ ჰიბრიდიზაცია). მჭიდროდ დაკავშირებულ ორგანიზმებს შორის თანმიმდევრული მსგავსების გამო, დნმ-ის ჰიბრიდების დნობისთვის უფრო მაღალი ტემპერატურაა საჭირო უფრო შორეულ ორგანიზმებთან შედარებით. სხვადასხვა მეთოდი იყენებს ჰიბრიდიზაციას დნმ-ის ნიმუშის წარმოშობის დასადგენად, მათ შორის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR). სხვა მეთოდით, დნმ-ის მოკლე თანმიმდევრობები ჰიბრიდირებულია უჯრედულ mRNA-სთან, გამოხატული გენების იდენტიფიცირებისთვის. ფარმაცევტული კომპანიები იკვლევენ ანტისენსიური რნმ-ის გამოყენებას არასასურველ mRNA-სთან დასაკავშირებლად, რაც ხელს უშლის რიბოსომას mRNA ცილად გადაქცევაში.
დნმ-დნმ-ის ჰიბრიდიზაცია ზოგადად ეხება მოლეკულური ბიოლოგიის ტექნიკას, რომელიც ზომავს გენეტიკური მსგავსების ხარისხს დნმ-ის თანმიმდევრობების აუზებს შორის. იგი ჩვეულებრივ გამოიყენება ორ ორგანიზმს შორის გენეტიკური მანძილის დასადგენად. იგი ფართოდ გამოიყენებოდა ფილოგენიასა და ტაქსონომიაში.
მეთოდი
დნმ ერთი ორგანიზმიდან იყო მარკირებული, შემდეგ შერეული არალეგირებული დნმ-ით, რომელიც შეიძლება შედარდეს მას. ნარევი ინკუბირებულია, რათა დნმ-ის ჯაჭვები დაიშალა და შემდეგ გაცივდეს, რათა შეიქმნას რეგენერირებული ჰიბრიდული ორჯაჭვიანი დნმ. მსგავსების მაღალი ხარისხის მქონე ჰიბრიდირებული თანმიმდევრობები უფრო მჭიდროდ აკავშირებს და საჭიროებს მეტ ენერგიას მათი განცალკევებისთვის: ე.ი.ტემპერატურა, ვიდრე განსხვავებული თანმიმდევრობები, პროცესი ცნობილია როგორც "დნმ-ის დნობა".
დნმ-ის დნობა
ჰიბრიდირებული დნმ-ის დნობის პროფილის შეფასებისას, ორჯაჭვიანი დნმ უკავშირდება ეგრეთ წოდებულ "სვეტს" და მიღებული ნარევი თბება. ყოველ საფეხურზე, სვეტი ირეცხება და დნმ-ის თანმიმდევრობები, რომლებიც დნება, ხდება ერთჯაჭვიანი და ჩამოირეცხება სვეტიდან. ტემპერატურა, რომლის დროსაც ეტიკეტირებული დნმ გამოდის სვეტიდან, ასახავს თანმიმდევრობებს შორის მსგავსების რაოდენობას (და თვითდაკეცვის ნიმუში ემსახურება როგორც კონტროლს). ეს შედეგები გაერთიანებულია ორგანიზმებს შორის გენეტიკური მსგავსების ხარისხის დასადგენად. თანამედროვე მიკრობიოლოგიის მიხედვით, დნმ-ის ჰიბრიდიზაცია შეუძლებელია ამ საგნების გაგების გარეშე.
როდესაც მრავალი რიბონუკლეინის მჟავას (ან დეზოქსირიბონუკლეინის) მჟავას სახეობები შედარებულია ამ გზით, მსგავსების მნიშვნელობები საშუალებას აძლევს სახეობებს მოთავსდეს ფილოგენეტიკურ ხეში. აქედან გამომდინარე, ეს არის ერთ-ერთი შესაძლო მიდგომა მოლეკულური სისტემატიკის ჩასატარებლად. ჩარლზ სიბლიმ და ჯონ ალკვისტმა, ამ ტექნიკის პიონერებმა, გამოიყენეს დნმ-დნმ-ის ჰიბრიდიზაცია ფრინველების ფილოგენეტიკური ურთიერთობების შესასწავლად (სიბლი-აჰლკვისტის ტაქსონომია) და პრიმატებს.
მნიშვნელობა ბიოლოგიისთვის
დნმ-დნმ-ის ჰიბრიდიზაცია არის ოქროს სტანდარტი ბაქტერიული სახეობების განმასხვავებლად, მსგავსების მნიშვნელობით 70%-ზე მეტი, რაც მიუთითებს, რომ შედარებული შტამები მიეკუთვნება სხვადასხვა სახეობებს. 2014 წელს შემოთავაზებული იყო 79%-იანი მსგავსების ზღვარი ბაქტერიული ქვესახეობის გამოყოფისთვის.
კრიტიკოსები ამტკიცებენ, რომ ტექნიკა არაზუსტია მჭიდროდ მონათესავე სახეობების შესადარებლად, რადგან ორგანიზმებს შორის ორთოლოგიურ თანმიმდევრობებს შორის განსხვავებების გაზომვის ნებისმიერი მცდელობა გადატვირთულია ორგანიზმის გენომში პარალოგური ანალოგიების ჰიბრიდიზაციით. დნმ-ის თანმიმდევრობა და გამოთვლითი თანმიმდევრობის შედარება ამჟამად ყველაზე გავრცელებული მეთოდია გენეტიკური მანძილის დასადგენად, თუმცა ეს მიდგომა ჯერ კიდევ გამოიყენება მიკრობიოლოგიაში ბაქტერიების იდენტიფიცირებისთვის.
მიმდინარე გზაა დნმ-დნმ-ის ჰიბრიდიზაციის ჩატარება სილიკონში სრულად ან ნაწილობრივ თანმიმდევრული გენომის გამოყენებით. DSMZ-ის მიერ შემუშავებული GGDC არის ყველაზე ზუსტი ცნობილი ინსტრუმენტი DDH-ის მსგავსი მნიშვნელობების გამოსათვლელად. სხვა ალგორითმულ გაუმჯობესებებს შორის, ის წყვეტს პრობლემას პარალოგური თანმიმდევრობების გულდასმით გაფილტვრით მათ გენომის ორ თანმიმდევრობას შორის შესატყვისებიდან.
FISH მეთოდი
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) არის ლაბორატორიული ტექნიკა, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის გამოსავლენად და თანმიმდევრობის დასადგენად, ხშირად კონკრეტულ ქრომოსომაზე.
1969 წელს ჯოზეფ გალმა და მერი ლუ პარდუმ გამოაქვეყნეს ნაშრომი, სადაც აჩვენეს, რომ რიბოსომური დნმ-ის თანმიმდევრობის რადიოაქტიური ასლები შეიძლება გამოყენებულ იქნას დამატებითი დნმ-ის თანმიმდევრობების აღმოსაჩენად ბაყაყის კვერცხუჯრედის ბირთვში. ამ ორიგინალური დაკვირვების შემდეგ, ბევრმა დახვეწამ გაზარდა მრავალფეროვნება დაპროცედურის სენსიტიურობა იმდენად, რამდენადაც in situ ჰიბრიდიზაცია („ადგილზე“, ლათ.) ახლა ციტოგენეტიკაში მნიშვნელოვან ინსტრუმენტად ითვლება. (ტერმინი in situ ახლა ასევე გამოიყენება კარცინომის ზრდის საწყის სტადიაზე, როდესაც პათოლოგიურ პროცესში ჩართულია მხოლოდ ეპითელური ქსოვილი.)
ფლუორესცენტური ჰიბრიდიზაციის თანმიმდევრობა
რნმ-ის ზონდები შეიძლება შეიქმნას ნებისმიერი გენისთვის ან გენში არსებული ნებისმიერი თანმიმდევრობისთვის, რათა მოხდეს lncRNA და miRNA mRNA ქსოვილებსა და უჯრედებში ვიზუალიზაცია. FISH გამოიყენება უჯრედების რეპროდუქციის ციკლის შესწავლით, კერძოდ, ბირთვული ინტერფაზის ნებისმიერი ქრომოსომული ანომალიისთვის. FISH საშუალებას გაძლევთ გაანალიზოთ საარქივო შემთხვევების დიდი სერია, იდენტიფიცირებული ქრომოსომის იდენტიფიცირება ბევრად უფრო ადვილია ხელოვნური ქრომოსომის ფუძის მქონე ზონდის შექმნით, რომელიც მოიზიდავს მსგავს ქრომოსომებს.
ჰიბრიდიზაციის სიგნალები თითოეული ზონდისთვის, როდესაც აღმოჩენილია ბირთვული ანომალია: თითოეული mRNA და lncRNA გამოვლენის ზონდი შედგება 20 წყვილი ოლიგონუკლეოტიდისგან, თითოეული წყვილი ფარავს 40-50 bp სივრცეს. გვ. ზონდები იყენებენ საკუთრების ქიმიას mRNA-ს გამოსავლენად.
ჰიბრიდიზაცია დნმ-ის ზონდებით
ზონდები ხშირად მზადდება დნმ-ის ფრაგმენტებისგან, რომლებიც იზოლირებულია, გაწმენდილი და გაძლიერებულია ადამიანის გენომის დიზაინში გამოსაყენებლად. ადამიანის გენომის ზომა იმდენად დიდია სიგრძესთან შედარებით, რომ შეიძლება უშუალოდ დაყოს, რომ აუცილებელია მისი დაყოფაფრაგმენტები. საბოლოო ჯამში, ეს ფრაგმენტები დალაგდა თითოეული ფრაგმენტის ასლის კიდევ უფრო მცირე ერთეულებად გადამუშავებით, თანმიმდევრობით სპეციფიკური ენდონუკლეაზების გამოყენებით, რათა გავზომოთ თითოეული პატარა ფრაგმენტის ზომა ზომის გამორიცხვის ქრომატოგრაფიის გამოყენებით ამ ინფორმაციის გამოყენებით, რათა დადგინდეს, თუ სად გადაფარავს დიდი ფრაგმენტები ერთმანეთს..
ელემენტების შესანარჩუნებლად მათი ინდივიდუალური დნმ-ის თანმიმდევრობით, ფრაგმენტები დაემატა მუდმივად განმეორებადი ბაქტერიების პოპულაციების სისტემას. ბაქტერიების კლონური პოპულაციები, თითოეული პოპულაცია ინარჩუნებს ერთ ხელოვნურ ქრომოსომას, ინახება მსოფლიოს სხვადასხვა ლაბორატორიებში. ხელოვნური ქრომოსომა (BAC) შეიძლება გაიზარდოს, ამოიღოს და დაინიშნოს ბიბლიოთეკის შემცველ ნებისმიერ ლაბორატორიაში. გენომიურ ბიბლიოთეკებს ხშირად უწოდებენ იმ დაწესებულებების სახელს, სადაც ისინი შეიქმნა. ამის მაგალითია RPCI-11 ბიბლიოთეკა, რომელსაც დაარქვეს როსველის კიბოს ინსტიტუტი ბუფალოში (ნიუ-იორკი, აშშ). ეს ფრაგმენტები შეადგენს დაახლოებით 100 ათას ბაზის წყვილს და წარმოადგენს FISH ზონდების უმეტესობის საფუძველს.
